CTLA4-Ig基因修饰骨髓间充质干细胞抑制大鼠肝移植排斥反应

摘要：目的：探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白（CTLA4-Ig）基因转染骨髓间充质干细胞（MSC）在抑制大鼠原位肝移植排斥反应的作用及机制。方法采用重组腺病毒（Ad）5-CTLA4-Ig转染MSC。转染72 h后，提取细胞总蛋白，采用蛋白质印迹法检测转染后MSC中CTLA4-Ig的蛋白表达。采用细胞计数试剂盒（CCK）-8方法检测未转染和转染后的MSC对外周血淋巴细胞增殖的抑制作用。以雄性Lewis大鼠为供体（40只）；以雄性Brown Norway （BN）大鼠为受体（40只）。采用改良的Kamada两袖套法进行原位肝移植，建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型。40只受体大鼠随机分为4组，每组10只。其中对照组（A组），于肝移植时门静脉输注生理盐水；MSC治疗组（B组），于肝移植时门静脉输注MSC；转基因MSC治疗组（C组），于肝移植时门静脉输注转基因MSC；免疫抑制剂治疗组（D组），于肝移植时门静脉输注生理盐水，术后即给予环孢素（CsA）1.5 mg /（kg·d）肌内注射，连续8 d。每组大鼠取5只观察生存情况。每组其余5只于术后第9日处死，检测外周血细胞因子白细胞介素（IL）-2、IL-4、干扰素（IFN）-γ水平，光学显微镜下观察肝组织病理学变化和排斥反应程度。结果重组Ad5-CTLA4-Ig转染MSC 72 h后，蛋白质印迹法可检测到转染后的MSC中有CTLA4-Ig的蛋白表达。当未转染的MSC∶外周血单核细胞比例为1∶10、1∶20时，MSC抑制淋巴细胞增殖的作用分别为85.60％、76.69％。重组Ad5-CTLA4-Ig转染MSC 72 h后，在相同的数量比下，其抑制淋巴细胞增殖的作用分别为90.50％、84.20％；与未转染的MSC 比较，转染后抑制淋巴细胞增殖的作用增强（P＜0.05）。A、B、C、D组大鼠肝移植术后存活时间分别为（13±3），（41±6），（90±15），（102±18）d。A、B、C组的大鼠术后存活时间比较差异有统计学意义（P＜0.05），C组和D组的大鼠术后存活时间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与A组比较， B组和C组的IL-4水平明显升高；与B组比较，C组的IL-4水平明显升高，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）；C组和D组的IL-4水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与A组比较，B组和C组的IL-2、IFN-γ水平明显降低，C组的IL-2、IFN-γ水平亦低于B组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05），C组和D组的IL-2、IFN-γ水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。大鼠肝组织病理检查结果显示，A组移植肝发生重度排斥反应，B组移植肝亦发生排斥反应，但与A组比较程度较轻。C组与D组移植肝有轻度排斥反应。结论重组Ad-CTLA4-Ig转染MSC可抑制肝移植排斥反应，其效果优于MSC单独应用。